不知道小伙伴在細胞培養(yǎng)過程中，有沒有遇到細胞消化過后，仍有些細胞分散不開，吹又不敢吹，棄又棄不凈，結(jié)果聚團細胞像滾雪球一樣越聚越大、越聚越多情況，細胞聚團原因是什么，是污染還是操作失誤，遇到細胞抱團如何處理呢?

我們知道當在生長培養(yǎng)基中進行單懸浮細胞培養(yǎng)時，樣本中出現(xiàn)細胞丟失的情況并不少見。當細胞破裂時，它們會釋放DNA和碎片，導(dǎo)致細胞聚集成大團塊，使其難以擴張。細胞聚團既可導(dǎo)致細胞凋亡，也可引起細胞死亡。隨著更多的細胞死亡并釋放碎片，問題將繼續(xù)惡化，所以盡可能快地處理或避免細胞聚團將有利于實驗的后續(xù)結(jié)果。

細胞聚團的原因

首先要明確一點，常規(guī)的“抱團”是指貼壁細胞被消化后懸浮狀態(tài)下的聚集情況。細胞在貼壁生長時，聚集在一起是正?，F(xiàn)象。當周圍細胞寥寥無幾，而這一團已經(jīng)疊層生長，這就是在懸浮狀態(tài)就已經(jīng)聚團的細胞再貼壁導(dǎo)致的。相同條件下，培養(yǎng)的癌細胞對密度依賴性的生長抑制敏感性降低，所以即使在形成單層后，也不會停止生長，而是相互堆積形成多層生長的聚集體。

防止細胞聚團的最佳方法之一是了解是什么導(dǎo)致了細胞聚集，并采取預(yù)防措施避免這些事件的發(fā)生。培養(yǎng)物中細胞可能聚集的一些原因包括：

1.過度消化

某些用于組織分解的酶，如胰蛋白酶，如果過量使用會導(dǎo)致細胞結(jié)塊。很多人覺得細胞多多益善，經(jīng)常將貼壁細胞養(yǎng)到疊層、或密集程度特別高時才進行傳代，如果一直這樣，不僅會縮短傳代時間，導(dǎo)致操作密集;同時細胞的老化會更加嚴重。另外，細胞死亡時釋放DNA，會“抓住”其他細胞，形成黏性的細胞團，若不及時處理，整體細胞狀態(tài)會惡性循環(huán)。

2.環(huán)境壓力

物理壓力和反復(fù)的溫度變化會導(dǎo)致細胞死亡，從而導(dǎo)致細胞的“粘性”的DNA分子將相鄰的細胞連接在一起

3.組織分解

在制備單細胞懸浮液時，使用酶、機械或化學(xué)分解策略可使細胞破裂，從而導(dǎo)致碎片的聚團。

4.過度生長

當細胞在其培養(yǎng)基中密度過大的時候，細胞將開始溶解并釋放碎片，碎片中的粘性因子會將細胞聚集到一起

5.污染

某些細菌和真菌病原體導(dǎo)致細胞溶解;結(jié)塊通常是細胞培養(yǎng)物被污染的跡象。部分細胞被污染后會出現(xiàn)細胞聚團，這和操作有很大關(guān)系，比如：傳代鋪板時，是否進行了活細胞計數(shù)并及時調(diào)整濃度;終止消化時間點是否準確;混勻是否過于輕柔或粗暴;胰酶是否濃度過高;離心收集時，加速度是否過大等，都會直接影響子代細胞狀態(tài)。

6.雖然其中一些是由于實驗錯誤而發(fā)生的，但實際也有部分的細胞具有天生的聚團現(xiàn)象，比如大部分的半懸浮細胞，BV-2 ,NCI-H716等等，半懸浮細胞一般在在整體匯合度70%左右就要進行傳代操作了，這樣可以降低細胞聚成大團塊的風(fēng)險。

為什么細胞聚團是個問題

單細胞懸浮培養(yǎng)基的目標是為靶細胞提供盡可能多的生長資源。這包括充足的生長營養(yǎng)和充足的繁殖空間。當細胞聚集在一起時，它們會相互限制，降低細胞對營養(yǎng)吞吐量，最終影響生長結(jié)果。

細胞聚團也會導(dǎo)致靶細胞的回收率降低，并且會干擾標記，這也是懸浮細胞標記的成功率不高的原因，某些細胞分析方法，如流式細胞術(shù)，需要對細胞進行適當?shù)姆蛛x。在流式細胞術(shù)中，大量細胞以快速的液流通過機器。這臺被稱為細胞儀的機器檢測不同細胞之間物理特性的差異，并使用熒光燈對它們進行相應(yīng)的標記。如果細胞通過試管時聚集在一起，細胞儀將很難準確測量它們的特性。這會導(dǎo)致它們被不正確地分類，并對實驗結(jié)果產(chǎn)生負面影響。

聚團細胞狀態(tài)都不好嗎

若細胞輪廓清晰，胞體通透，呈串狀均勻聚集，證明其狀態(tài)較好，正在分裂。但是大多數(shù)情況下，聚團細胞都是輪廓模糊，細胞透光性差，甚至出現(xiàn)合胞體，同時伴有細胞碎片，這證明細胞已經(jīng)衰老或者產(chǎn)生病變，狀態(tài)不佳。

如何避免聚團細胞的生成

首先確認當前細胞生長密度及狀態(tài)，80%左右的生長密度即可進行傳代，此時細胞狀態(tài)較好，且用于傳代的數(shù)量也足夠。

傳代操作前，使用緩沖液對細胞進行適當且全面地潤洗，清除死亡的細胞團和部分堆疊雜質(zhì)(在選擇適當胰酶濃度時，對于不同代數(shù)的不同細胞系需進行一定的調(diào)整，如：部分貼壁牢固的細胞應(yīng)將胰酶分裝后，進行預(yù)熱處理;細胞密度過高時，應(yīng)該向胰酶中加入少量緩沖液，緩慢均勻地消化細胞等。對于貼壁格外牢固的細胞，可以嘗試多次分批進行消化，最大限度保證細胞狀態(tài))。

在消化過程中，需均勻慢速晃動培養(yǎng)器皿，以免局部胰酶濃度過高而影響傳代。切勿用力搖動，導(dǎo)致邊緣松動的大片細胞直接脫落，從而增加細胞成團幾率。

培養(yǎng)器皿的選擇也需注意，部分實驗室會使用玻璃培養(yǎng)瓶，因細胞貼壁在玻璃底更容易分離。同時玻璃材質(zhì)的親水性和塑料有區(qū)別，而且玻璃細胞培養(yǎng)瓶都是實驗室內(nèi)部處理，可能會有清潔殘留，在一定程度上抑制細胞的貼壁生長，并且更容易消化，細胞之間的連接比貼壁還要緊密，聚團幾率很大。

另外，避免傳代過程中匯合度較大，本身1:3甚至1:4都可以正常培養(yǎng)的細胞被1:2傳代，會導(dǎo)致母代細胞濃度過高，在分化過程中出現(xiàn)堆疊現(xiàn)象，所以在每次細胞傳代前要對細胞進行計數(shù)。

適當?shù)奶幚砗驮O(shè)備使用，也可以減少結(jié)塊。如果使用離心機分離或混合樣品，將其設(shè)置為正確的速度可以減少聚團，通常情況下，較快的速度可以離心散細胞，但在高速下也必須考慮細胞的脆弱性，所以適當?shù)难娱L離心的時間也不失為一種穩(wěn)靠的離心散懸浮聚團細胞的方法。

還有一些方法可以分離細胞，這些細胞聚集在一起，不會造成過度的傷害。某些叫做螯合劑的化學(xué)物質(zhì)與正電荷離子有親和力。根據(jù)細胞聚團的性質(zhì)，可以添加螯合劑來溶解它們之間的粘連，而不會傷害細胞。乙二胺四乙酸(EDTA)是一種螯合劑，常用于溶解鈣粘連。

另一種細胞清除方法是氚化。氚化過程涉及到溫和、重復(fù)的吸管，以打破細胞間的弱粘。

已經(jīng)聚團的細胞，只能棄掉嗎

如果預(yù)實驗比較緊急，或者細胞株較為珍貴，也可以在復(fù)蘇新細胞的同時，進行聚團細胞“拯救”。

可以將帶有聚團細胞的樣品低密度連續(xù)傳代，約三代過后，逐漸分散為獨立個體，再通過監(jiān)測細胞活力狀態(tài)，判斷是否可用來進行下游實驗。若肉眼可見，即可直接通過清洗和吸出，或是在消化后將懸起的細胞樣品靜置數(shù)十秒以沉淀團塊。對于死細胞聚團，可以在細胞液中適量加入DNase以斷裂DNA。